A11-1 組換えタンパク質の発現生産、精製

ユニット名

支援担当者

支援技術のキーワード

動物細胞発現系、糖タンパク質、タグシステム、構造解析、抗体

支援技術の概要

「高難度な疾患関連蛋白質の調製とその構造解析のための特殊改変」を特異とする本グループが、構造解析や創薬研究に供するための高難度蛋白質生産を支援する。主に下記の3つの項目を行う。

動物細胞発現系を用いた糖蛋白質の発現と精製：本グループの特色である、（i）動物細胞を用いた高品質発現系の採用、（ii）糖鎖修飾変異株をつかった糖鎖均一化エンジニアリング、（iii）独自のアフィニティータグシステムを駆使した一段階高速精製、などの特徴を活かし、創薬研究および基礎生物学研究に供する「高難度蛋白質」の発現精製を行う。

構造均一化シャペロンの生産とその標的複合体化およびその構造解析：「高難度蛋白質」の結晶化やクライオ電顕単粒子解析を阻む、試料の構造的均一性の低さを克服するには「構造均一化シャペロンとの複合体化」が有効であるので、そのような「シャペロン」の取得と複合体化を支援する。具体的には、抗体やバインダーペプチド、あるいは受容体の場合はリガンドそのものを調製する。とくに抗体については、結晶化を極めて容易にする小型抗体様式である「Fv-clasp」に変換することも行う。

創薬ターゲット抗体の改変と組み換え生産：配列が公知の抗体（特に医薬として承認されているもの）の小スケール（数ミリグラム）生産は、研究開発上需要が高い。そこで、可変部（CDR）配列情報を供与いただき、それを望みのIgG型の組み換え抗体として構築、生産する。

支援技術の利用例

1）超迅速構造解析支援の例（糖転移酵素GnT-V）
day 1 メールにて打診、コンサルテーション
day 3 DNA受領、コンストラクトデザイン開始
day 20 発現テスト開始、最適化
day 50 スケールアップ、PAタグ精製
day 58 結晶化スクリーニング
day 68 2Åデータセット取得、S-SADデータ取得
day 98 位相決定、モデル構築終了
（このうち、生産と精製に要したのは１０日間！）

2）構造均一化抗体作成の例（抗HGF抗体）
がん進展に関わる肝細胞増殖因子（HGF）は６つのドメインからなるフレキシブルなマルチドメインタンパク質であり、これまでその全長構造はもちろん、受容体結合部位であるSPドメインとその上流のK4ドメインを含む断片も立体構造情報が得られていない。HGFの前駆体型から成熟型への変換メカニズムを解明したいというがん生物学者からの依頼に応じ、このタンパク質の結晶構造解析を支援した。まず複数の抗HGFモノクローナル抗体を作成し、それらをFabもしくはFv-claspの状態で「結晶化シャペロン」として用いることで、下図のように複数のHGF断片の立体構造を決定することに成功した。

3）医薬抗体の組み替え発現精製
(i) Sotrovimab（SARS-CoV-2スパイク蛋白質抗体） (ii)テセントリク（抗PD-L1抗体）

支援担当者の研究概要

当研究グループでは、「生体膜」近傍での生物学的現象を蛋白質構造化学の目で切り取り、生物学研究の新たなステージを切り開くため、最新の構造生物学的手法を駆使した研究を行っている。細胞は外からの刺激を受容してその情報を細胞内で処理し、外的環境にたいしてどう対処するかを決定するが、ここで対象とするのは、ヒトの疾患に関わる種々の膜蛋白質、特に、脳・神経系で働く受容体やシナプス構成因子、神経細胞死や軸索ガイダンスに関わる分子、生物の発生や形態形成に関わるシグナル分子などの蛋白質である。レセプターが細胞外でその特異的パートナー（リガンド）と結合する際に起こる構造上の変化を「可視化」することが求められるが、そのために用いる構造生物学の手法はX線結晶構造解析と電子顕微鏡イメージングである。それらに用いるタンパク質試料の調製（発現と精製）や、巨大で不安定な複合体を結晶化する技術にはまだ改良の必要な点が数多くある。たとえばヒトを含む高等生物の細胞外リガンドやその受容体は組み替え発現・精製が困難で有り、既存の生産システムに依存していては、国際的な競争に勝つことができない。そこで、困難な組み替えタンパク質の「生産」を、動物細胞培養系の高度化、新しいアフィニティタグシステムの開発、発現法の改良・開発、などを通して確立することを目指している。本事業では、それらのノウハウと独自技術を結集し、外部研究者が構造・機能解析に供するための「高難度創薬ターゲット蛋白質」の生産を支援する。