A13-2 タンパク質X線結晶解析支援

ユニット名

支援担当者

支援技術のキーワード

膜タンパク質、抗体作製技術、結晶化促進技術、X線結晶構造解析

支援技術の概要

構造解析ユニットで実施されるタンパク質試料の調製から構造機能解析の一連の研究のうち、特に疾病関連膜タンパク質の生産と構造解析の支援を行う。膜タンパク質は多くの疾病に関連するため、重要な創薬標的分子として知られているが、ヒト膜タンパク質は安定性（耐熱性）が低いため精製することが難しい場合が多く、創薬研究のボトルネックになっていた。千葉大では、長年にわたり膜タンパク質に焦点を当てた基礎研究を推進し、ST1：理論的耐熱化変異体作製技術、ST2：迅速精製技術、ST3：結合化合物探索・評価技術、ST4：機能性抗体作製技術、ST5：構造解析技術（KEKと共同）を開発した。一方、JAXAではST6：膜タンパク質の新規結晶化技術を、理研ではST7：タンパク質複合体の大腸菌無細胞合成技術を開発した。本事業では上記の支援技術（ST1-ST7）を広く外部研究者に公開し、実際に技術支援を行うことにより、創薬研究でボトルネックになっていた膜タンパク質の生産問題を解決し、日本の創薬研究とライフサイエンス研究の発展に貢献することを目的とする。

本支援メニュー（タンパク質のX線結晶構造解析）に該当するST4：機能性抗体作製技術、ST5：構造解析技術（X線結晶構造解析）、ST6：膜タンパク質の新規結晶化技術について以下に概要を記載する。それ以外の支援項目については別の支援メニューに記載する。

ST4：機能性抗体の作製技術　担当：千葉大―ヒト膜タンパク質に対する機能性抗体の作製は、「免疫寛容」と「抗原調製が難しい」ことから困難な場合が多かった。我々は精製した膜タンパク質をリポソームに再構成して抗原とし、自己免疫疾患マウスへ大量（mg）に免疫し、変性した標的分子に結合しない立体構造を認識する抗体作製技術（特許第5526448号）を開発した（図１）。これまでに実施した抗体作製では、標的分子の機能を制御する機能性抗体が高い割合（6割以上）で含まれている。

ST5：膜タンパク質の構造解析技術（X線結晶構造解析)　担当：千葉大―ST4で得られた抗体フラグメントを標的膜タンパク質に結合させることで、揺らぎの固定化と抗体の高い結晶化能により複合体の結晶化が促進され、ヒトアデノシンA_2A受容体、ラット糖輸送体、ヒトバンド3、バクテリア膜酵素NOR、ヒトアディポネクチン受容体など様々な疾病関連膜タンパク質のX線結晶構造を得ることに成功している（Nature 2012, 2015ab; Science 2011, 2015)（図２)。

ST6：膜タンパク質の高分解能結晶化技術　担当：JAXA―阪大・中川教授らとJAXAが開発した結晶化促進技術（特開2021-12733号）を適用する。標的膜タンパク質の配列情報を用いて発現から結晶化までをワンストップサービスで提供する。本技術はLCP法、バイセル法、ゲルチューブ法、蒸気拡散法などの結晶化に適合する。
精製膜タンパク質は通常の方法での結晶化のほかにJAXAで宇宙実験に用いている結晶化手法を使うことで、結晶品質の向上を目指す。これまでに、結晶化促進技術により得られた膜タンパク質結晶が宇宙実験で分解能が向上した実績がある（図３）。

支援技術の利用例

ST4：機能性抗体の作製技術―本技術を用いて支援依頼者の標的膜タンパク質に対するモノクローナル抗体を作製する。

ST5：膜タンパク質の構造解析技術（X線結晶構造解析)―支援依頼者の標的膜タンパク質についてNative-PAGE法等で性状評価を行う。一定基準を満たしたサンプルに対してX線結晶構造解析を行う。

ST6：膜タンパク質の高分解能結晶化技術―膜タンパク質に応じた発現系を選択したのち、本技術を適用し、宇宙実験技術と組み合わせて、大量発現・精製・結晶化をワンストップで支援する。さらなる高品質結晶が求められる試料については、積極的に宇宙実験への搭載を検討・実施し、高精度な構造解析を進める。

支援担当者の研究概要

補助事業代表者：千葉大学　村田 武士
＜施設・設備・機器＞代表者（村田）は「千葉大学大学院理学研究院附属・膜タンパク質研究センター」を令和3年10月に設立した。本センターに所属する教員３名、研究員２名、技術員５名が本事業に参画予定であり、支援・高度化を行うのに十分な人材が揃っている。また、村田の研究室から大学院生６名程度も本事業に参画予定である。膜タンパク質を発現・精製する設備や機器類、理論計算や構造解析する計算機・コンピューターなど、本事業に必要となる設備・機器は完備されている。ST4で使用するBiacoreはKEKの装置を使用する。
＜技術＞膜タンパク質研究を支援するための革新的な技術（ST1-ST5）が確立されており、十分な支援実施体制が整っている。
＜これまでの支援実績等＞
・AMED　創薬等支援技術基盤プラットフォーム（PDIS）「創薬ターゲットとして重要なヒト膜タンパク質の生産及び結晶化支援基盤」の分担者として、岡山大学、京都大学、自治医科大学、徳島大学、早稲田大学、千葉大学、化学品メーカー、製薬企業等から支援依頼を受け(支援件数：12件)、膜タンパク質の生産と結晶化およびX線結晶構造解析に関する技術支援を行なった（論文成果： Nature 2015ab, Science 2015, JBC 2016など）。
・AMED　創薬等ライフサイエンス研究支援基盤事業（BINDS）「全自動大規模結晶化スクリーニングシステムを用いたX線結晶構造解析の支援と高度化」の分担者として、北海道大学、東北大学、新潟大学、東京大学、東京理科大学、京都大学、大阪大学、岡山大学、産業技術総合研究所、国立循環器病研究センター等から支援依頼を受け(支援件数：14件)、膜タンパク質の発現・精製・性状評価・結晶化・構造解析及び抗体作製に関する技術支援行った（論文成果：Nat. Chem. Biol. 2018, 2019, Nature 2021など）。
・AMED　創薬等ライフサイエンス研究支援基盤事業（BINDS）「創薬等ライフサイエンス研究のための相関構造解析プラットフォームによる支援と高度化」の分担者として、アクセリード社、アステラス製薬、小野薬品工業、第一三共ノバーレ、武田薬品工業の５社から支援依頼を受け、非競争領域である毒性（hERG）／動態（P-gp）ターゲットの発現・精製系を確立およびクライオ電子顕微鏡を用いた構造解析支援を行なった（論文成果：Structure 2021など）。

補助事業分担者：宇宙航空研究開発機構　岩田 茂美
＜施設・設備・機器＞分担者（岩田）はJAXAが実施する「高品質タンパク質結晶生成（PCG）実験」を担当している。当実験では微小重力環境を利用したタンパク質結晶化実験で日本国内の研究者を10年以上にわたり支援しており、研究者5名、技術員2名が参画する。発現から精製、結晶化までの一連の研究に必要な設備が揃っている。
＜技術＞膜タンパク質研究を支援するための技術（ST6）が確立されており、十分な支援実施体制が整っている。
＜これまでの支援実績等＞岩田が所属するPCGプロジェクトでは微小重力環境での結晶化を10年以上支援してきた（支援PI数120以上、論文発表100件以上、特許申請2件(特開 2019-196326　VEGF結合阻害剤、特開2019-034934号　ペプチド型細菌ジペプチジルペプチダーゼ７阻害剤）。PCG実験の結果を利用して大鵬薬品工業により開発された薬剤はAMED CiCLE事業に採択され現在第3相試験が実施されている。(https://www.taiho.co.jp/release/2021/20210105.html)