B1-1 機能ゲノミクス解析支援

ユニット名

支援担当者

支援技術のキーワード

大規模機能ゲノミクス解析、シングルセルRNA-seq、バルクRNA-seq、ゲノムシーケンス解析、統合データ解析

支援技術の概要

実験計画から、サンプル受領、核酸抽出、ライブラリー調製、シーケンス、データ解析までの機能ゲノミクス解析について、プロセスごとにコンサルテーションを行いながら統合的に支援する。

＜ライブラリー作製、シーケンス解析、統合データ解析＞

①CAGE解析（転写開始点解析）：理研で独自開発したssCAGE法を用いて、5'端のCAP構造を有するRNA分子（mRNA, long non-coding RNA, enhancer RNAなど、non-poly(A) RNAも含む）を特異的に捉える技術。得られたデータからFASTQ、TSSデータを生成し、網羅的かつ定量的にプロモーターおよびエンハンサー活性ならびに遺伝子の転写開始点を測定し、遺伝子アノテーション、活性推定などの解析結果を提供する。また、各種細胞・組織から細胞質分画を取り除いて核分画を単離し、新たに合成中のRNA（新生RNA）が濃縮されている核不溶分画の抽出法が既に確立している。新生RNAにCAGE法を応用し、エンハンサーRNA（eRNA）と呼ばれるノンコーディングRNAの転写開始点を同定するNET-CAGE法を新規メニューとして提供する。

②シングルセルRNA解析：外部研究者等の目的に応じて、RamDA-seq、SMART-seq、3’ Gene Expression（10xGenomics社）の3種の方法によりシングルセルRNA解析の支援を実施する。

・RamDA-seq：理研で開発されたRT-RamDA法を用いて、1細胞毎の全トランスクリプトームシーケンス用のライブラリーを調製する。なお、ライブラリー調製には、市販のTn5 transposaseを用いた通常のRamDA-seqと低コスト化のために高度化で独自調製したTn5 transposaseを使用したin house RamDA-seqを提供する。得られたデータからFASTQ、Count、FPKM-TPMデータを生成し、網羅的かつ定量的にポリA型RNA、非ポリA型RNA、エンハンサーRNAを測定する。遺伝子アノテーション、遺伝子発現量などの解析結果を提供する。

・SMART-seq：SMART-seq2法を用いて、1細胞毎の全トランスクリプトーム解析を行う。得られたデータからFASTQ、Read Count、FPKM/TPMデータを生成し、網羅的かつ定量的にポリA型RNAを測定する。遺伝子アノテーション、遺伝子発現量などの解析結果を提供する。

・シングルセル遺伝子発現解析（10xGenomics）：10xGenomics社Chromium iXを使用して、500～10,000細胞のシングルセルを用いたライブラリー調製を行う。これまで提供していたSingle Cell 5’/3’ Gene Expression Kitに加えて、最大2倍の遺伝子を検出することができるGEM-X Single Cell 5’/3’ Kitの支援も提供する。得られたデータからLoupe Browser用のloupeファイルとCell Rangerで出力したhtmlファイルを生成し、網羅的かつ定量的にポリA型3’ RNAを測定する。遺伝子アノテーション、遺伝子発現量などの解析結果を提供する。

③バルクRNA解析：以下の2種の方法によりバルクRNA解析を実施する。実験デザインの相談から、ライブラリーの構築、シーケンス、データ解析、統計解析まで一貫して支援する

・RNA-seq：Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina（NEB社）を用いて、ストランド非特異的なcDNAライブラリーを調製する。rRNA除去またはpoly(A) mRNA濃縮と併用することで、10 ngから1μgまでのTotal RNAから高品質なライブラリーを調製する。得られたデータからFASTQ、Read Count、FPKM/TPMデータを生成し、網羅的かつ定量的にポリA型RNAを測定する。遺伝子アノテーション、遺伝子発現量などの解析結果を提供する。

・3' mRNA-Seq：QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit（Lexogen社）を用いて、poly(A) mRNAの3'末端近郊配列をもつcDNAライブラリーを調製する。得られたデータからFASTQ、Read Count、FPKM/TPMデータを生成し、網羅的かつ定量的にポリA型3’ RNAを測定する。そして、遺伝子アノテーション、遺伝子発現量などの解析結果を提供する。

④ターゲットシーケンス解析：理研で独自開発されたmultiplex PCRを用いた手法により、ゲノムDNAを材料として、特定の遺伝子（領域）に絞って多数検体のシーケンス解析を行う。実験デザインのコンサルテーションから、ライブラリーの調製、シーケンス、データ解析、統計解析まで一貫して支援する。また近年、加齢に伴い血液中にsomaticバリアントが集積するクローン性造血（CHIP）が注目を集めており、新規メニューとしてCHIPの対象となる約15遺伝子に対するターゲットシーケンス解析を提供する。

⑤全ゲノムシーケンス解析：ゲノムDNAを材料として全ゲノムシーケンスを実施する。実験デザインのコンサルテーションから、ライブラリー調製、シークエンス解析、バリアントリストの作成や疾患やフェノタイプとの関連解析までを一貫して担当する。

⑥高機能セルソーターを用いた各種免疫細胞の分画：従来の免疫細胞ソーター技術をさらに高度化した詳細なサブセットの分離法を確立しており、共同研究レベルでの支援として提供する。また、この新規技術で分離されたサブセットに対する機能ゲノミクス解析についても検討する。

⑦統合データ解析：上記の機能ゲノミクス解析を対象として、複数のゲノミクス解析結果を統合的に解析するマルチゲノミクス解析を支援する。特に、RNAとゲノム変異や多変量解析等の異なる手法に基づくデータの統合解析を支援するとともに、ターゲットの絞り込み、各種統計手法を用いた検証等多面的な解析支援を行う。また、支援先自体のデータ解析を可能とするために、様々なツールの提供および解析手法に関するコンサルテーションを行い、データ解析技術の展開も併せて行う。

支援技術の利用例

10万人以上を対象としたBRCA1/2遺伝子の14がん種を横断的解析
－東アジアに多い3がん種へのゲノム医療の可能性－
理研が独自に開発したターゲットシークエンス法により、バイオバンク・ジャパンが保有している日本人集団における14種のがんについて、がん患者とその対照群の合計10万人以上を対象とした世界最大規模のがん種横断的ゲノム解析を行った。その結果、BRCA1/2遺伝子は既に関連が知られている乳がん、卵巣がん、前立腺がん、膵がんの4がん種に加えて、東アジアに多い胃がん、食道がん、胆道がんの3がん種の疾患リスクを高めることを発見した。この結果は、BRCA1/2遺伝子に病的バリアントを持つ患者に対して、既知の4がん種だけでなく新たに同定した3がん種についても、早期発見スクリーニングの実施や、PARP阻害剤の治療効果が期待できることを示した。（Momozawa Y et al. JAMA Oncol.2022）　

遺伝要因がピロリ菌感染の胃がんリスクを高めることを解明
－ピロリ菌除菌によりその高まったリスクを低減できる可能性－

前述のターゲットシークエンス法により、バイオバンク・ジャパン・愛知県がんセンター病院疫学研究（HERPACC）の胃がん約11,000名と非がん対照群約44,000名に対して遺伝性腫瘍関連遺伝子27個に対して大規模ゲノム解析を行った。その結果、BRCA1/2遺伝子に加え、7個の遺伝子が胃がんリスクと関連しており、遺伝子毎に臨床的特徴が大きく異なっていることを明らかにした。更に、同定した遺伝子群の中の相同組換え修復機能に関わる遺伝子がピロリ菌感染と交互作用を伴い胃がんリスクを大きく上昇させる現象を発見した。相同組換え修復機能に関わる遺伝子に病的バリアントを持つ人はより一層ピロリ菌感染の評価・除菌を考慮することが重要であることを示唆するものである。これらの結果を通じて、胃がんのメカニズムの解明および個別化リスク低減策などが期待できることを示した。（Usui Y et al., NEJM, 2023）

支援担当者の研究概要

支援に必要とされる要素技術とデータ解析の開発（高度化）を行う。大規模機能ゲノミクス解析支援に係るDNA/RNA 解析技術の高度化に加え、ゲノム研究を機能ゲノミクス研究に結び付ける方法論の確立を目指し「ヒト免疫機能評価」研究を対象領域とした高度化を実施する。機能ゲノミクス分野の高度化では、支援として多く利用が見込まれるDNA/RNA 解析技術を選択し、技術開発及びメニュー化を目指すとともに、当該分野における新たな技術開発の動向に応じて、新規技術の高度化について企画・検討する。ヒト免疫機能評価研究における高度化として、ヒト免疫システムを構成する多様な免疫担当細胞サブセットの機能解析の進歩を目指す。

大規模機能ゲノミクス解析支援に係るDNA/RNA技術の高度化
・シングルセルRNA解析の低コスト化及び自動化
・Somatic全ゲノムシーケンス解析
・Somaticターゲットシーケンス解析

免疫細胞のサブセット解析と遺伝的変異との関連付けを目的としたDNA/RNAを中心とした多層的な機能分子の解析技術の高度化
・細胞分離法の高度化
・次世代シーケンサー（NGS）を用いた大規模解析の高度化
・転写因子結合部位マッピングと遺伝的変異
・ゲノム編集実験システムの確立

※高度化課題の社会への普及・実用化に向けた取り組みとして、技術開発を活用した共同（連携）研究を推進する。